Las enzimas líticas de los bacteriófagos (Enzibióticos): nuevas terapias contra las infecciones bacterianas

Recientemente se ha demostrado que ciertas enzimas de los bacteriófagos (virus que infectan a las bacterias) llamadas endolisinas pueden usarse como nuevas herramientas terapéuticas contra las infecciones bacterianas. Estas nuevas armas, denominadas enzibióticos, se han usado con éxito para controlar infecciones causadas por bacterias patógenas resistentes a antibióticos en modelos animales. Las endolisinas presentan dominios específicos que permiten a la enzima anclarse selectivamente sobre una pared bacteriana concreta, al tiempo que poseen un módulo catalítico capaz de hidrolizar el peptidoglicano bacteriano. Investigaciones recientes han revelado no sólo la sorprendente diversidad catalítica de estas enzimas, sino que han proporcionado también avances en su organización modular, en sus estructuras tridimensionales a nivel atómico y en su mecanismo de reconocimiento de la pared bacteriana. Así, se ha mostrado, por primera vez, cómo la proteína se une y degrada la pared de las bacterias; un resultado que puede ser clave para el desarrollo de los enzibióticos. Todos estos resultados permiten considerar a las endolisinas como efectivos bactericidas con importantes aplicaciones en medicina y biotecnología.

La resistencia a los antibióticos se ha incrementado en países como España y Francia y se extiende rápidamente por todo el mundo

Los expertos en enfermedades infecciosas han alertado sobre la imperiosa necesidad de desarrollar tipos completamente nuevos de agentes antibacterianos. La resistencia a los antibióticos se ha incrementado en países como España y Francia y se extiende rápidamente por todo el mundo. De hecho, muchos de los antiguos antibióticos bien han dejado de ser eficaces o bien son mucho menos fiables que antes. Las enfermedades causadas por el neumococo (uno de los principales patógenos humanos) tales como neumonía, bacteriemia, meningitis, otitis o sinusitis afectan de forma particular a niños, ancianos y grupos con problemas de inmunodeficiencia. Así, la neumonía es la enfermedad infecciosa con mayor tasa de mortalidad en el mundo, con unos 3,5 millones de muertes al año, un tercio de los cuales son niños menores de 5 años.

Recientemente se ha demostrado que las endolisinas (proteínas de los bacteriófagos que rompen la pared bacteriana) son ese nuevo tipo de agentes terapéuticos. Estos agentes, denominados enzibióticos, tienen un amplio rango de aplicación que va desde la medicina (son capaces de eliminar cepas de neumococo altamente resistentes a penicilina) hasta la lucha contra el bioterrorismo (los enzibióticos pueden eliminar al microbio causante del ántrax). Desde el descubrimiento oficial de los fagos en 1917 por Félix d'Hérelle, fue evidente que su potente capacidad bactericida podía aplicarse al tratamiento de las enfermedades infecciosas humanas. Sin embargo el desarrollo e industrialización de los antibióticos alrededor de los años 1940 provocó un abandono de esta área de investigación. Hoy en día, el interés por los fagos ha crecido de nuevo para poder controlar bacterias patógenas que han desarrollado resistencia a algunos, y ciertos casos a todos, los antibióticos probados clínicamente. La capacidad predadora de los fagos queda de manifiesto por el hecho de que, según estimaciones recientes, cada 48 horas la mitad de la población bacteriana mundial es destruida por los fagos.

Figura 1: Imagen por microscopía electrónica de los bacteriófagos de neumococo Cp-1

Tras la infección a la bacteria, los fagos producen endolisinas que, una vez translocadas a la pared celular bacteriana (normalmente mediante unas proteínas de membrana denominadas holinas), se unen al principal polímero estructural -llamado peptidoglicano- y rompen los enlaces requeridos para su estabilidad, produciendo una lisis hipotónica y la posterior liberación de la progenie fágica (Figura 2).

Figura 2: Esquema del ciclo lítico de los bacteriófagos

	Estos agentes, denominados enzibióticos, tienen un amplio rango de aplicación que va desde la medicina hasta la lucha contra el bioterrorismo

En los últimos años se ha probado que, in vitro e in vivo, la adición de estas endolisinas purificadas eliminaban streptococci del grupo A y Streptococcus pneumoniae de la nasofaringe de animales colonizados experimentalmente. Muy recientemente se ha descrito un modelo animal que reproduce las infecciones en el oído medio (otitis media). En este modelo, los ratones eran infectados vía infección intranasal primeramente con Streptococcus pneumoniae y posteriormente con virus influenza (ya que se supone que la otitis media involucra también virus respiratorios como el influenza). Usando este modelo animal se demostró que la endolisina del fago Cp-1 (denominada Cpl-1) específica por neumococo era no solamente capaz de eliminar la colonización con S pneumoniae sino también de prevenir el desarrollo de otitis media en los ratones.

Figura 3: Cristales de Cpl-1 en complejo con el peptidoglicano bacteriano

En nuestro grupo hemos utilizado la técnica de difracción de rayos X para determinar la estructura tridimensional del enzibiótico Cpl-1 unido a fragmentos de la pared bacteriana. Para ello ha sido necesario obtener, mediante el uso de robots de cristalización, microcristales del complejo Cpl-1 con el peptidoglicano (Figura 3) y posteriormente irradiarlos con unos potentísimos rayos X generados en el sincrotrón ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) de Grenoble (Francia). Este sincrotrón es un enorme acelerador de partículas capaz de producir los rayos X más intensos del mundo. El análisis de los datos así obtenidos ha permitido conseguir una imagen tridimensional a resolución atómica de la interacción entre Cpl-1 y el peptidoglicano (Figura 4A). La estructura tridimensional muestra que Cpl-1 presenta dos módulos proteicos bien diferenciados: un módulo de anclaje que permite a Cpl-1 unirse específicamente a las moléculas de colina sólo presentes en la pared del neumococo y otro módulo proteico dotado de una potente maquinaria catalítica de degradación del peptidoglicano (Figura 4B).

De este modo, la información estructural ha permitido esclarecer el mecanismo mediante el cual el enzibiótico se une selectivamente a la pared del neumococo y revela la maquinaria molecular de Cpl-1 implicada en el reconocimiento y degradación de la bacteria. Estos resultados nos han dado, por primera vez, una imagen de cómo Cpl-1 se une y elimina en pocos segundos al neumococo.

Figura 4: (A) Estructura tridimensional del enzibiótico Cpl-1. En verde se representa el módulo catalítico y en azul y morado el módulo de anclaje a la pared. Ambos módulos se encuentran unidos por un conector (naranja). El fragmento del peptidoglicano se representa como esferas rojas. (B) Modelo de interacción de Cpl-1 (en verde) con la pared bacteriana

En paralelo a la caracterización estructural, el grupo de los Drs. Pedro García, José Luis García y Ernesto García del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) han caracterizado bioquímicamente tanto los fagos como sus endolisinas y probado su capacidad enzibiótica tanto in vitro como in vivo. La caracterización biofísica ha sido llevada a cabo por el grupo de la Dra. Margarita Menéndez del Instituto de Química-Física "Rocasolano" (CSIC).

Las investigaciones mencionadas con fagos y endolisinas se enmarcan dentro de un proyecto mucho más amplio llamado COMBACT y en el blog asociado y que pretende encontrar nuevas dianas que puedan afectar la viabilidad de las bacterias patógenas. Este consorcio está integrado por grupos de investigación, en la primera línea de la investigación mundial en este campo, ubicados todos ellos en la Comunidad de Madrid y ha recibido el soporte de la Comunidad de Madrid dentro del Programa de Actividades de I+D en Biociencias 2007-2010.

Los resultados obtenidos en la caracterización de las endolisinas abren, por tanto, nuevas vías, con importantes repercusiones farmacológicas

Los resultados obtenidos en la caracterización de las endolisinas abren, por tanto, nuevas vías, con importantes repercusiones farmacológicas, para desarrollar mediante técnicas de ingeniería de proteínas nuevos agentes antimicrobianos aún más potentes y específicos. Si tenemos en cuenta que los enzibióticos limitan la dispersión de la enfermedad y matan a la bacteria diana por contacto, estas enzimas podrían usarse en unos pocos años como componentes de sprays antibacterianos, pastillas, colutorios, vendas, colirios o incluso caramelos. Los sprays nasales con estas enzimas podrían ser una alternativa efectiva a los antibióticos convencionales. Todo ello con la ventaja añadida de dejar intactas al resto de la flora bacteriana de nuestro organismo, en su mayor parte beneficiosa o inocua, y que es eliminada indiscriminadamente por los antibióticos convencionales.

Los bacteriófagos son las entidades biológicas más abundantes de nuestro planeta y constituyen, por tanto, una fuente natural de potentes endolisinas. La combinación de esta enorme diversidad natural con el aumento de la información estructural y de las herramientas metagenómicas, perfilan un escenario muy prometedor para encontrar o diseñar "a la carta" nuevos enzibióticos específicos para cualquier especie patógena de bacteria.